안녕하세요.
KZRC 홈페이지에 있는 돌연변이 라인 대부분은 6 dpf 이전에 표현형이 나타납니다.

그런데 정확히 어떤 라인이 6 dpf 이전에 표현형이 나타나지 않는지는 구체적으로는 확인이 어렵습니다.

보다 정확한 정보를 확인하시려면, 돌연변이 라인 정보에 기재된 참고 문헌을 확인해 보시는 것을 권장 드립니다.

안녕하세요
여쭤보신 부분에 대한 답변은 아래와 같습니다.

말씀 하셨던 것처럼 소규모 deletion/insertion의 경우에 저희는 크게 두 가지 실험 방법을 주로 이용하고 있습니다.

1. 4 bp 미만의 mutantion인 경우, gel 상에서 확인하기 어려워서 gDNA에서 PCR을 한 뒤에 sanger sequencing으로 genotyping을 하고 있습니다.

2. 4 bp (insertion/deletion) 이상의 mutation인 경우, 4% agarose gel (TBE buffer 사용)을 사용하여 전기영동 결과에서 band의 사이즈로 mutant를 확인합니다. mutant line을 제작한 후 처음에 확인할 때만 sequencing으로 확인하고, 그 이후에는 4% gel 결과만 가지고 판단합니다. (WT band와 mutant band의 사이즈가 차이 나며 hetero는 WT과 mutant band 모두 보여야합니다.)

3. 실험의 효율성을 위해서 4% gel 전기영동만으로 확인할 수 있는 mutant line이라면 이 방법을 추천하고, 이 방법으로 확인이 불가한 경우에만 RE digestion (deletion부분에 RE site를 포함한 경우)이나 sequencing을 권장합니다.

KZRC에서는 adult genotyping시에는 Q-tip method를사용하녕하세요
여쭤보신 부분에 대한 답변은 아래와 같습니다.

말씀 하셨던 것처럼 소규모 deletion/insertion의 경우에 저희는 크게 두 가지 실험 방법을 주로 이용하고 있습니다.

1. 4 bp 미만의 mutantion인 경우, gel 상에서 확인하기 어려워서 gDNA에서 PCR을 한 뒤에 sanger sequencing으로 genotyping을 하고 있습니다.

2. 4 bp 이상의 mutation인 경우, 4% agarose gel을 사용하여 전기영동 결과에서 band의 사이즈로 mutant를 확인합니다. mutant line을 제작한 후 처음에 확인할 때만 sequencing으로 확인하고, 그 이후에는 4% gel 결과만 가지고 판단합니다. (WT band와 mutant band의 사이즈가 차이 나며 hetero는 WT과 mutant band 모두 보여야합니다.)

3. 실험의 효율성을 위해서 4% gel 전기영동만으로 확인할 수 있는 mutant line이라면 이 방법을 추천하고, 이 방법으로 확인이 불가한 경우에만 RE digestion (deletion부분에 RE site를 포함한 경우)이나 sequencing을 권장합니다.

KZRC에서는 adult genotyping시에는 Q-tip method를 사용하여 실험하고 있습니다. 실험 방법은 support > q-tip genotyping 탭에서 확인할 수 있습니다.

Ref: Jang JY, Liang T, Kim MK, Kang KW, Lee B, Choi SY. A Rapid and Noninvasive Method That Extracts Polymerase Chain Reaction-Ready Genomic DNA from Adult Zebrafish. Zebrafish. 2022 Aug;19(4):160-164.​


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Genotyping에 전문가이신 순천향대학교 순천향의생명연구원 김현택교수님도 상기 질문에 관해 아래와 같이 답변을 주셨습니다.

Mutant line의 genotyping관련 분의에 대한 추가 답변을 드립니다.

1. 7bp deletion mutant의 경우, 선생님께서 디자인 하신 primer의 PCR amplicon (236 bp)으로는 2-4% gel에서 구분하기가 쉽지 않을겁니다. PCR ampicon을 100 bp 미만으로 디자인 하시면 구분이 가능할걸로 판단됩니다.

2. RFLP의 경우 대부분 연구자분들이 6 bp를 인식하는 Restriction enzyme만을 찾으시던데, 4-5bp를 인식하는 (예, AsuI g/gncc) restriction enzyme들이 많이 있기에, 따라서 webcutter등의 tool에서 mutation site를 인식하는 enzyme이 있는지를 wildtype과 mutant (del 7) 서열 모두에서 찾아보시면 RFLP도 왠만하면 가능할것으로 판단됩니다.
3. 가장 명확한 genotype은 sanger seq이지만, 비용 및 시간이 들기에, 현재 가장 편리한 genotype방법은 위의 1번 방법이며, 또 다른 방법으로는 T7E1 방법이 있을 수 있겠습니다. 그러나 T7E1과 RFLP도 거의 비슷한 시간이 소요됩니다.

제가 추천드리는 방법은, HRMA (high-resolution melting analysis)이고 저희 실험실은 오래전부터 사용하고 있으며, 최근 충남대학교 김철희교수님연구실도 setup해서 사용하는 방법이며, 전세계적으로 널리 사용되는 방법입니다.

원리는 qPCR machine으로 PCR amplicon의 melting temperature (curve) 차이를 구분하여 1 base substitution도 wildtype과 구분할수 있는 방법이므로 indel mutation에 아주 적합한 방법입니다.
시간 소요는 2-3시간이면 genotype이 가능하며, genomic DNA를 분리하고, qPCR (1시간)로 genotype이 가능합니다.


혹시 문의 사항이 있으시면,
김현택, hyun-taek.kim@sch.ac.kr로 이메일 주십시오.

안녕하세요
저희 실험실에서 cryosection하는 방법은 다음과 같습니다.
1. 4% PFA로 O/N fixation
2. 1.5% agarose, 10% sucrose 용액(10 g sucrose+ 1.5 g agar + 100 ml 3차 DW)에 embryo를 embedding (embedding mold 사용)
3. 굳으면 embedding mold에서 꺼낸 뒤 block을 최대한 작게 컷팅 (blade 사용)
4. 30% sucrose (50 ml PBS + 15 g sucrose)를 15 ml tube에 10 ml정도 넣고 embryo가 들어있는 block을 넣고 4︒C, O/N.
5. block이 tube 밑바닥에 가라앉으면 꺼내서 물기를 제거하고 liquid nitrogen에 닿지 않게 냉기로 서서히 굳힘

이렇게 굳힌 block을 OCT compound로 chuck에 붙여서 cryotome으로 section합니다.

최근에 저희 실험실에서는 3 dpf zebrafish embryo에서 paraffin block을 만들고 H&E staining 조건을 잡고 있습니다. 이때 사용한 방법은 fix된 embryo를 cassette 보다 조금 큰 사이즈로 자른 육수다시팩(크린랩 다시백) 사이에 넣고 paraffin cassette에 넣고 닫아서 기계로 paraffin processing 했습니다.

논문을 보면 paraffin block 만들 때 1% agrose에 embryo를 embedding한 후에 paraffin processing하는 방법도 있는데, 그건 저희 쪽에서도 제대로 해보진 않았습니다.

그리고 원하신다면 저희 KZRC에서 cryosection 직접 배울수도있습니다.

안녕하세요?

문의해 주셔서 감사합니다. 어느 stage의 microglia를 보기 원하시는지요? Stage에 따라 사용할 수 있는 라인이 달라서요.

아래 논문을 참고해서 어느 stage의 microglia를 보기 원하는지 알려주시면, KZRC에서 구해 드리겠습니다.

Ferrero G, Mahony CB, Dupuis E, Yvernogeau L, Di Ruggiero E, Miserocchi M, et al. Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb‑dependent definitive microglia in zebrafish. Cell Rep. 2018;24(1):130–41.

우리 KZRC에 올라오는 질문의 수준이 갈수록 높아지는 것 같아 기쁩니다.

해당 분야의 전문가인 충남대 노현주 교수님께서 아래와 같은 답을 해주셨습니다. 아무쪼록 도움이 되었으면 좋겠습니다.
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안녕하세요.

충남대학교 생물과학과의 노현주 교수입니다.

제브라피쉬에서 phiC31을 이용하는 방법은 2013년 하버드 대학교 Lon Zon 교수 연구실에서 처음 시도된 방법입니다. 추후 safe harbor region이 human과 zebrafish에서 발견되면서 추 후 개발이 되었습니다. 우선 CRISPR/Cas9을 이용하여 phiC31(serine integrase) landing site인 attB를 genome(safe harbor)에 심어놓고 attP가 함유된 donor vector를 넣어주고 리컴바인 시켜주는 방법입니다. Gateway에서 사용되는 tyrosine integrase보다 간단하기에 현재 합성생물학 영역에서 선호 되는 방법입니다.

하지만 질문자의 의도는 Gal4 사용시 개체간 변이가 크다는 문제가 있는 것으로 보입니다. 질문자의 말씀처럼 Tol2는 무작위 적으로 genome에 삽입되기 때문에 당연히 발생하게 되는 문제입니다. 물론 phiC31을 이용한다면 이런 문제점을 해결할 수 있겠지만 Gal4/UAS system의 태생적인 더 큰 문제가 있습니다. 바로 gene silencing 문제입니다. 세대가 거듭되면서 UAS에 존재하는 CpG dinucleotide에 메틸화가 되는 현상을 피할 수가 없습니다. 또한 GAL4/UAS system이 그리 강력한 발현을 유도하지도 않습니다.

저희도 이 문제에 직면해서 다른 시스템을 개발하여 논문 발표를 한적이 있습니다. 바로 IQ-switch 입니다. 이것은 GAL4/UAS보다 수 배가량 더 강력하고 gene silencing문제에서 자유롭습니다. 물론 여기에서도 개체간 변이는 있는데 transgenic animal을 만들 때 alpha-crystalin – EGFP, mCherry, Cyan 같은 같은 selectable marker를 이용하여 가장 강한 marker 발현(lens 에서)을 보이는 개체를 선택해 키우고 있습니다. 이 시스템은 binary system이기 때문에 mating과 tebufenozide라는 약물을 처리해서 유전자 발현을 유도할 수 있습니다. 따라서 하나의 allele가 문제된다고 해서 물고기의 발생이나 유전자 발현의 문제가 생기지는 않습니다.

IQ-Switch is a QF-based innocuous, silencing-free, and inducible gene switch system in zebrafish https://www.nature.com/articles/s42003-021-02923-3

All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184

안녕하세요 답변 드리겠습니다.

[1]
사육 제브라피쉬 질환에 관해서는 다음 논문을 참고하시고, 정확한 원인 규명을 위해서는 해당 물고기에 병리검사가 필요합니다. KZRC와 협약을 맺은 국가 병성감정(病性鑑定)기관인 전남대학교 여수캠퍼스 수산질병관리원과 협업을 통해 원인질환 규명이 가능합니다.

그리고 민간기업으로는 메디피쉬 수산질병관리원 (https://medifish.co.kr)이 있습니다.

Kent ML, Sanders JL, Spagnoli S, Al-Samarrie CE, Murray KN. Review of diseases and health management in zebrafish Danio rerio (Hamilton 1822) in research facilities. J Fish Dis. 2020 Jun;43(6):637-650. doi: 10.1111/jfd.13165. PMID: 32291793.

[2]
제브라피쉬 암컷은 장기간 교미가 이루어지지 않을 경우, 체내에 난자가 비정상적으로 축적되어 복부 팽창 및 척추 만곡 등의 생리적 이상이 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위한 방법 중 하나는 수컷과 암컷을 동일 수조에서 사육함으로써 자연적인 교미를 유도하는 것입니다. 이러한 방식은 산란을 통해 비정상적인 난자의 축적을 해소하는 데 효과적입니다.

본 실험실에서는 이와 같은 생리적 이상을 사전에 예방하기 위해, 대부분의 라인을 대상으로 정기적인 교미를 실시하고 있습니다. 이를 통해 건강하지 않은 알은 자연스럽게 제거되며, 번식력 유지 및 실험 재현성 확보에 도움이 됩니다.

또한, 이러한 이상 징후는 대부분 생식력이 저하된 고령의 암컷에서 자주 관찰됩니다. 따라서 저희 실험실은 원칙적으로 생후 1년 이상 경과한 성체는 폐기하고, 건강한 다음 세대를 지속적으로 유지·관리하고 있습니다.

안녕하세요.

제브라피쉬는 4cm까지 안 커도 2.5 ~ 3cm 정도가 되어도 브리딩 가능합니다.

알을 낳을 수 있는 시기는 사육 환경마다 다릅니다. (2cm ~ 3cm 사이에도 가능)

큰 케이지에서 제브라피쉬 밀도를 줄여서 먹이를 많이 줄 시 2달 안에도 브리딩이 가능합니다.

저희에게 분양신청서를 작성해 주시면 물고기 분양은 가능 합니다.

감사합니다

안녕하세요.

테트라 비트는 15 dpf 이후 부터 주시면 되고, 치어용 Gemma Micro도 사용 가능 합니다.

다만 치어를 테트라 비트를 줄 시 많이 갈아야 합니다.

저희는 알테미아는 아침, 저녁만 급여를 하고 있고, 테트라 비트는 점심에 추가적으로 급여가 필요할 시 급여를 하고 있습니다.



감사합니다.

안녕하세요

저희는 Tetra Bits를 주고 있습니다.
치어가 먹기에는 너무 커서 저희는 따로 갈아서 주고 있습니다.

또한 Adult용 Gemma가 있습니다.
부화 후 15일 까지는 치어용 75를 사용하고, 15~ 30일 까지는 치어용 150을 사용하고,
30일 이상은 성어용 300을 사용하시면 됩니다.

안녕하세요.
아래 논문의 Table 3을 참고하시면 됩니다.
Choe CP, Choi SY, Kee Y, Kim MJ, Kim SH, Lee Y, Park HC, Ro H. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 2021 Sep 8;37(1):26. doi: 10.1186/s42826-021-00103-2. PMID: 34496973; PMCID: PMC8424172.

이 논문은 KZRC 홈페이지에서 바로 보실 수 있습니다.

저희 실험실에서는 cyp19a1b 물고기는 가지고 있지 않습니다.

cyp19a1a 물고기는 female somatic cells에서 발현하는 것을 확인하려면 적어도 13 dpf 이후에 확인하셔야 합니다.

감사합니다.

안녕하세요.

1. Tissue specific Cre-lox system이나 Inducible Cre-lox system을 사용하시면 됩니다.

2. KZRC에서 분양하는 CRISPER/Cas-9 K/O zebrafish는 line 마다 다르지만 대부분 heterozygous 상태로 제공됩니다.

감사합니다.

질문하신 Inbreeding 문제는 2년에 한 번씩 다른 실험실에서 물고기를 공급 받아 outcross를 진행하는 것이 좋습니다.

우리 KZRC에서 inbreeding이 적은 WT 라인을 공급하고 있습니다.

감사합니다.

안녕하세요.

Zebrafish 치어(5 dpf ~ 14 dpf)를 키울 때는 충분한 물의 양이 필요합니다.

좁은 공간에서 키울 경우 성장이 저해되거나 폐사가 발생할 수 있으므로, 충분한 면적을 확보하고 먹이 공급과 수질 관리를 철저히 해주세요. 치어가 Artemia를 섭취할 수 있는 크기(14 dpf)까지 성장하면 시스템으로 옮겨 기르는 것이 좋습니다.

또한, 시스템으로 옮길 때 물이 한 방울씩 떨어지도록 조절하여 물고기가 스트레스를 받지 않도록 하는 것이 중요합니다.

추가적으로, 질문하신 WT fish는 2년에 한 번씩 다른 실험실에서 WT를 공급받아 outcross를 진행하는 것이 좋습니다.

우리 KZRC에서도 inbreeding이 적은 WT 라인을 공급하고 있습니다.

감사합니다.

안녕하세요.

선생님 저희가 가지고 있는 pDestTol2pA2_#394 라는 Plasmid는 있습니다.

첨부한 pDestTol2pA2_#394.ape 파일을 확인 부탁드립니다.

감사합니다.

안녕하세요.

KZRC 연구원 장도원 입니다.

1. 이동 중 죽는 개체가 죽어 수량이 변동되는 경우는 괜찮은지
- 이동 중에 죽은 개체는 다 체크 후 따로 보관 후 신고를 하셔야 합니다.

2. 이동 과정 중 hatching이 진행되는 경우에는 수입신고를 어떻게 진행해야하는지
- hatching이 진행이 되어도 문제는 없습니다.

감사합니다.

안녕하세요.

수도권 및 경기도에 사육장을 보유하고 있는 실험실은

경희대학교 의과대학 이윤성 교수님
경희대학교 강동호 교수님
고려대학교 의과대학 박해철 교수님
서울과학기술대학교 김기태 교수님
서울대학교 최경호 교수님
서울대학교 의과대학 석승혁 교수님
성균관대학교 임화선 교수님
숙명여자대학교 김민정 교수님
용인대학교 지경희 교수님

가 있습니다.

감사합니다.

안녕하세요.

해당 제품을 구매하실 수 없는 경우, Blocking Reagent (11112589001) 이 고려 해보시길 바랍니다.

고려대학교에서도 insitu에 사용하고 있다고 합니다.

https://www.sigmaaldrich.com/KR/ko/search/11112589001?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=11112589001&type=product

감사합니다.

안녕하세요.

저희가 지금 사용하고 있는 배양기는 LAB HOUSE에서 판매하는 저온 배양기 입니다.

모델 명은 BI-250 이고 아래에 홈페이지 URL을 남겨드리겠습니다.

http://www.labhouse.co.kr/bbs/board.php?bo_table=product3&wr_id=19

감사합니다.

안녕하세요 KZRC 입니다.

먼저 물고기방은 항상 온도를 26도로 셋팅을 해주셔야 됩니다.

그리고 아침에 Mating cage에 있는 물을 새로운 물로 바꿔줘서 온도를 맞춰 줍니다.

그러고 난 뒤 알을 받아서 죽은 알을 제거한 후 28도 인큐베이터에 넣어 줍니다.

그날 저녁에 퇴근하기 전에도 물고기 알 상태를 확인하고 죽은 알을 제거하고 새로운 물로 갈아준 후 다음날 아침에도 죽은 알 제거 및 새로운 물로 바꿔서 28도 인큐베이터에 다시 넣어주고
이 작업을 4일동안 반복하고 사육실로 옮기면 됩니다.

저희는 이렇게 Embryo를 받아서 키우고 있습니다.

감사합니다.

안녕하세요, KZRC입니다.

Fixation을 진행하실 때는 특정 부위만 고정하는 것이 아니라 제브라피쉬의 몸 전체를 고정하는 것이 검체의 위치를 보다 쉽게 조정하는 데 도움이 됩니다.

Fixation을 진행할 때 여러 마리를 동시에 고정을 진행하셔야 원하는 Sample를 얻을 수 있습니다.

저희는 한 블럭당 Fixation을 4마리를 동시에 고정하며, 두 마리는 아래를 보고 두 마리는 위에를 보게 하는 방법으로 진행합니다.

이렇게 하면 dissection 할 때 더 많은 sample을 얻을 수 있고, 원하시는 위치의 절편을 얻을 수 있는 확률도 높아질 것입니다.

Section은 많은 연습이 필요한 실험이므로, Fixation과 Section을 반복적으로 연습하시는 것이 좋겠습니다.

추가적으로 참고하실 수 있도록 저희 실험실에서 작성한 Protocol를 첨부해 드립니다.

감사합니다.

안녕하세요 KZRC입니다.
문의하신 배아 사육 방법 및 조건에 대해서 답변드리겠습니다.

온도는 28도를 맞춰 주시고 핫플레이트 안에 물은 Egg Water를 만들어서 갈아주면서 키우면 됩니다.
3 dpf에서부터는 상온에서 사육이 가능하고, Rotifer 또는 입자크기가 작은 분말 먹이를 급여해 주고 15 dpf에서부터 artemia를 급여하여 키우시면 됩니다.
아침 9시부터 저녁 10시까지 만 전등 불빛이 들어와야 사육환경에 도움이 됩니다.
Egg Water, Rotifer ​, artemia 정보는​ KZRC 홈페이지의 Support - Reagents & Equipments 혹은 Recipes에 나와있습니다.

추가로 Egg Water가 준비가 어려우면 시중에 나와있는 생수로 사육이 가능합니다.
생수 브랜드는 상관없이 모두 사용이 가능하고 정수기 물은 사육이 어렵습니다.

잘 아시는 것처럼 제브라피쉬 배아는 난황(yolk)을 가지고 태어나는데, 초기 영양분은 여기에서 공급 받습니다. 그러나 10 dpf 정도 되면 난황이 완전 고갈되는데, 이때 외부 영양분 공급이 충분하지 않으면 물고기가 죽게 됩니다.

감사합니다.

안녕하세요 KZRC 입니다.
문의에 관련하여 논문하나 보내드리도록 하겠습니다.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3072245/​Dynamic Smad-Mediated BMP Signaling Revealed Through Transgenic Zebrafish

논문에서 보면 somite muscle cell, notochord, midbrain-hindbrain neurons 등 다양한 곳에 발현한다고 나와있습니다.
이는 larvae stage에서 확인한 것입니다.

혹시 실험에 관련되어 있으면 분양신청하시면 분양은 가능합니다.

안녕하세요. KZRC 입니다.
문의 해주신 zebrafish 사육 환경은 저희가 선생님 실험실로 현장 방문하여 원인을 찾아 답변 드리도록 하겠습니다.
자세한 사항은 이메일로 알려드리겠습니다.

안녕하세요. KZRC 입니다.​
현재 저희 실험실에서는 다량의 치어를 사육하고 있기 때문에 로티퍼(rotifer)를 키워서 급여하고 있습니다.
이외에도 제브라피쉬를 사육하는 타 실험실의 경우 파우더 형태의 젬마(gemma)를 급여 하는 방식을 사용하고 있습니다.
위 같은 경우 파우더 형태를 바로 수조에 급여 하게 되면 금방 물이 탁해지므로 수질 관리에 있어서 다른 방식에 비해 더욱 신경을 써주어야 합니다. 급여 10분이 지난 후 수면 위의 잔여 사료를 스펀지로 걷어내는 방식으로 수질을 관리하여 치어를 사육하시는 것이 죽는 현상을 줄이는데 도움이 됩니다.

▶로티퍼 구매 사이트:
https://aquasm.com/html/index.html
▶젬마 구매 사이트:
http://21cht.com/search?keyword=gemma

저희 실험실에서 사용하는 물품들은 저희 홈페이지 support 탭에서 확인하실 수 있습니다.

안녕하세요. KZRC 입니다. 문의하신 사항에 대해 답변드리겠습니다.
아래 첨부해드린 사진을 참고해주세요.
1. 전반적인 배수시설 사진입니다.
2. 트렌치 깊이는 총 6cm이고 배수로는 5cm 입니다.
3. 바닥에 배수펌프로도 운용이 가능합니다. (출처: 국립해양생물자원관 정승현 박사)

안녕하세요. KZRC 입니다.
문의하신 사항에 대해서 답변드리겠습니다.아래 첨부한 사진을 참고해주세요.

배아 꼬리지느러미 절단 기법

1. 1 ml팁 끝을 자른다.
2. 파이펫을 이용하여 3 dpf embryo 한마리를 petri dish에 옮긴다.
3. embryo주변 물기를 파이펫을 이용하여 제거한다.
4. 1 ml syringe의 바늘을 이용하여 현미경을보고 fin을 조금 자른다.
5. fin을 잘린 embryo주변에 egg water을 조금 넣고 다시 파이펫으로 petri dish에 옮겨준다.